鼻咽癌与EB病毒（EBV）密切相关。血浆中癌源性EBV DNA是一种有效的肿瘤标志物，可用于癌症检测、预后和监测。目前，基于突变、甲基化和片段组学的不同ctDNA分析方法已在不同癌症阶段的检测中进行了探索和评估。但研究ctDNA分析是否可以在癌症筛查环境中带来积极的临床影响同样重要。鼻咽癌为探讨该问题的临床影响提供了一个很好的模型。

近日，中国科学院院士、香港中文大学校长卢煜明教授团队在Cancer Cell发表文章“Fragmentomics profiling and quantification of plasma Epstein-Barr virus DNA enhance prediction of future nasopharyngeal carcinoma”，评估了血浆EBV DNA片段组学分析在鼻咽癌筛查中的临床应用价值。在前瞻性队列中，研究团队分析了PCR检测EBV DNA阳性受试者的第一轮筛查血液样本，发现在第二轮筛查中发展为鼻咽癌的患者表现出独特的单核小体大小模式、鼻咽癌相关的末端基序（特别是CC基序缺失）和甲基化异常（FRAGMA分析）。值得注意的是，具有这些异常片段组学特征和较高EBV DNA数量的受试者在第二轮筛查发生鼻咽癌的相对风险是PCR检测EBV DNA阴性受试者的87.1倍。该研究表明，血浆EBV DNA片段组学分析可以预测鼻咽癌的未来风险。

研究亮点

• 发现血浆EBV DNA存在与鼻咽癌相关的片段组学特征；

• 血浆EBV DNA片段组学和定量分析可增强鼻咽癌风险预测；

• EBV DNA阳性受试者第二轮筛查发生鼻咽癌的相对风险是阴性受试者的87.1倍。

研究内容及结果

2013年至2016年，研究团队招募了20174名无症状男性受试者（40-62岁）纳入前瞻性筛查队列，使用实时PCR检测EBV DNA。经过第一轮筛查，发现了34例鼻咽癌患者。43个月后，使用相同的PCR筛查方案进行了第二轮筛查（排除34例鼻咽癌病例），发现了24例鼻咽癌患者。研究重点关注了第一轮血浆EBV DNA结果短暂阳性和持续阳性的受试者，并评估了在第二轮中被/不被识别为鼻咽癌个体的第一轮血液样本EBV DNA分子的定量和片段组学特征，包括大小、末端基序和基于片段组学的甲基化分析（FRAGMA分析）。

图1. 研究队列和受试者选择

研究团队分析了参加第二轮筛查的所有17,838名受试者的第一轮血浆EBV DNA结果。第一轮筛选中，血浆EBV DNA短暂阳性677例，持续阳性237例，其中包括7名受试者（3名短暂阳性，4名持续阳性），他们随后在第二轮中被确诊鼻咽癌（图1）。

研究团队还利用靶向测序分析了在第二轮筛查中会/不会发现鼻咽癌受试者之间血浆EBV DNA水平是否存在定量差异。数据显示，第二轮筛查中鉴定出鼻咽癌的7名受试者中，EBV DNA占靶DNA片段总数的中位数比例显著高于短暂阳性或持续阳性的非鼻咽癌受试者（图2）。

图2. 利用靶向测序进行第二轮筛查受试者血浆EBV DNA的定量分析。

已有研究表明，鼻咽癌患者的血浆EBV DNA呈单核体大小模式，峰值频率约为160 bp，而无鼻咽癌的人群中不存在这种特征。因此，研究人员对第二轮筛查的鼻咽癌受试者、短暂阳性和持续阳性的非鼻咽癌受试者的血浆EBV DNA片段大小分布进行了探讨（图3）。

对于在第二轮筛查中发现鼻咽癌的受试者，其第一轮血液样本的血浆EBV DNA具有单核小体大小模式。相比之下，未识别鼻咽癌受试者的血浆EBV DNA没有类似的大小分布模式。对于片段大小差异分析，第二轮确诊鼻咽癌的7名受试者血液样本的EBV DNA大小比（中位数）显著低于短暂阳性、持续阳性的非鼻咽癌受试者样本。此外，研究团队还使用ONT的长读长测序进一步分析了长血浆EBV DNA分子，发现大多数EBV DNA是小于200 bp的短DNA片段，小部分DNA片段长度大于500 bp，最长的为1,665 bp，提示鼻咽癌患者血浆中存在较长的EBV DNA片段。

图3. 血浆EBV DNA的大小分析

对于另一个片段组学生物标志物血浆EBV DNA的末端基序的分析显示，鼻咽癌组和非鼻咽癌组之间的末端基序存在显著差异。探索数据集分析发现，8个端基序（TT、AT、GT、TC、CT、TG、AA和TA）在鼻咽癌样本中显示出较高的比例，被归类为“鼻咽癌富集端基序”；2个末端基序（CC和GG）在鼻咽癌样本中的比例较低，被归类为“鼻咽癌耗尽末端基序”。研究团队基于此提出一个指标，即鼻咽癌相关EBV DNA末端基序得分，定义为血浆EBV DNA中鼻咽癌富集末端基序比例与鼻咽癌缺乏末端基序比例的相对比率。基于此，第二轮筛查识别的7名鼻咽癌受试者的鼻咽癌相关EBV DNA末端基序得分中位数显著高于非鼻咽癌受试者，包括短暂阳性或持续阳性非鼻咽癌受试者。（图4）

图4. 血浆EBV DNA的末端基序分析

FRAGMA分析是卢煜明院士团队研发的一种全新早筛技术，在不使用亚硫酸盐处理的情况下，通过分析片段组学的基序切割模式来推断cfDNA的甲基化状态。该研究利用FRAGMA方法发现在鼻咽癌患者中，血浆EBV DNA高甲基化CpG位点的CGN/NCG基序比率显著高于低甲基化CpG位点的基序比率（图5A），表明分析CGN和NCG基序比率可用于推断血浆EBV DNA的甲基化。

分析显示，当前队列中第二轮筛查的7例鼻咽癌患者血浆EBV DNA调整后的中位数CGN/NCG基序比值显著高于暂时阳性或持续阳性非鼻咽癌受试者（图5B）。在第二轮发现鼻咽癌患者的第一轮血液样本中，血浆EBV DNA的高调整的CGN/NCG基序比率表明，他们的甲基化谱与已建立的鼻咽癌患者相似。

图5.FRAGMA分析血浆EBV DNA的基于片段化的甲基化状态

上述分析表明，鼻咽癌受试者血浆EBV DNA与未筛查出鼻咽癌的受试者存在截然不同的分子特征，包括数量、大小、末端基序和甲基化状态（FRAGMA分析），因此这些特征在第二轮筛查中能够区分鼻咽癌患者与非鼻咽癌患者。研究团队进一步模拟了整个筛查队列中纳入该分子分析进行风险预测的性能，发现与PCR检测EBV DNA阴性的个体相比，血浆EBV DNA在数量、大小、末端基序和FRAGMA分析方面具有相关分子特征的受试者发生鼻咽癌的相对风险为87.1倍。值得注意的是，通过PCR单时间点检测结合血浆EBV DNA分子分析，风险预测性能提高了10倍以上（即7.6倍）。

表1.不同EBV DNA分子特征受试者的鼻咽癌发展相对风险

结 语

该研究表明，血浆EBV DNA的独特片段组学特征存在于没有立即可识别的鼻咽癌但未来可能发展为鼻咽癌的高风险个体中。研究团队提出的血浆EBV DNA分子分析将影响鼻咽癌筛查方案，进一步提高癌症的风险预测性能。这种早期发现的改善也有助于提高患者的生存效益，使筛查发现的早期鼻咽癌患者获得更好的无进展生存期。

论文原文：

W.K. Jacky Lam, Guannan Kang, Charles M.L. Chan, et al.Fragmentomics profiling and quantification of plasma Epstein-Barr virus DNA enhance prediction of future nasopharyngeal carcinoma. Cancer Cell, 6 March 2025. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.02.002