肿瘤的发生发展涉及恶性细胞与肿瘤微环境（TME）之间复杂且持续的相互作用。开发能够再现肿瘤生物学特性及免疫疗法效果的患者特异性肿瘤免疫微环境实验模型，将极大地推动免疫肿瘤疗法的患者选择、靶标识别以及耐药机制的研究。最近，斯坦福大学的Calvin J. Kuo教授团队在《Nature Reviews Cancer》发表了名为 ：Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironment的综述。这篇综述探讨了当前可用的和快速发展的三维肿瘤类器官模型，并重点阐述了基于类器官的肿瘤免疫研究、药物开发以及精准医疗领域的多种应用前景。

研究背景：

现代的肿瘤生物学观点强调肿瘤微环境（TME）的多因素作用。肿瘤可以被类比为器官/组织，其复杂的细胞微环境对癌症的持续存在至关重要。基质成分，如细胞外基质（ECM）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和血管系统等，对肿瘤进展有着重要影响。免疫系统在肿瘤进展过程中扮演着双重角色：恶性转化细胞首先逃避免疫系统的监测和破坏，然后利用炎症反应创造一个有利于肿瘤进展的微环境。

类似急性炎症的肿瘤免疫浸润与预后良好相关，包括CD8+ T细胞、CD4+ T辅助细胞1（TH1细胞）、自然杀伤（NK）细胞、II型固有淋巴细胞（ILC2s）、嗜酸性粒细胞、M1型巨噬细胞、CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）高表达单核细胞和1型树突状细胞（DC1s）。密集的肿瘤内免疫浸润，如三级淋巴结构（TLSs），能够将T细胞和B细胞诱导为肿瘤反应性效应细胞和记忆细胞，并产生终末分化的肿瘤浸润性CD8+效应T细胞。具有上述免疫特征的肿瘤在免疫学上被称为“热肿瘤”，通常是免疫疗法的优秀候选者（图1a）。

相比之下，免疫“冷”肿瘤在免疫学上类似于慢性炎症，并通过产生基因毒性应激、诱导增殖、增强血管生成和组织浸润来驱动肿瘤发生发展。此类免疫浸润包括M2型巨噬细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）、CD4+ T辅助细胞2（TH2细胞）、调节性T细胞（Treg细胞）、多种状态的终末耗竭CD8+ T细胞、调节性B细胞（Breg细胞）、CCR2高表达的单核细胞以及富含免疫调节分子的成熟树突状细胞（mregDCs）。这种免疫微环境能够产生促血管生成因子、生长因子和存活因子，并抑制CD8+效应T细胞。

为了重建抗肿瘤免疫功能，多种细胞和生物免疫疗法致力于提高免疫效应细胞的质量和/或数量。通过使用中和T细胞激活抑制剂（如CTLA4或PD1）的抗体进行免疫检查点阻断（ICB），已在多种难治性癌症和晚期实体瘤中取得了成功，同时其他途径如LAG3、TIM3和TIGIT也在研究中。联合疗法，如双重检查点阻断（CTLA4联合PD1或LAG3联合PD1），已改善了部分患者的生存率，而ICB联合肿瘤导向抗体或靶向治疗（如BRAF或MEK抑制剂）正处于早期研究阶段。此外，双特异性T细胞衔接剂直接将T细胞靶向肿瘤抗原，如CD19、CD20和肿瘤坏死因子受体超家族成员17（TNFRSF17，也称为BCMA），针对巨噬细胞吞噬途径的抗体阻断也被提出。联合激活T细胞和巨噬细胞（抗GD2和抗CD47）或工程化T细胞与抗CD47、抑制非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2（PTPN2）和其同源的PTPN1，以及抗体亲和力工程也正在研究中（图1b）。

表达肿瘤特异性嵌合抗原受体（CARs）的自体T细胞是细胞免疫疗法的典型例子。采用外周血扩增的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）回输的过继T细胞转移方法，在PD1耐药性黑色素瘤、宫颈癌和非小细胞肺癌（NSCLC）中取得了客观反应。TIL方法因其具有多克隆抗原特异性而尤为重要。设计用于识别HLA呈递的肿瘤抗原的T细胞受体（TCR）工程化自体T细胞，目前正在进行I-III期临床试验。其他替代性细胞免疫疗法包括CAR巨噬细胞（CAR Ms）和主要组织相容性复合体（MHC）独立的CAR NK细胞，这些疗法也正在进行临床研究（见图1c）。

癌症2D细胞系和传统的3D类器官模型通常只代表肿瘤上皮，而不包含免疫细胞，这使得它们在模拟人类TME和免疫治疗反应时存在一定局限。随着TME定义和3D类器官技术的双重进展，为增加体外癌症模型的细胞复杂性提供了可能，尤其是免疫成分。这篇综述探讨了类器官技术应用于免疫TME建模的最新进展，总结了重组和原生免疫类器官系统及其在理解肿瘤免疫生物学、研究免疫疗法以及精准医学中的应用。

图1：靶向肿瘤免疫微环境，促进有效的抗肿瘤免疫应答

肿瘤免疫类器官系统

类器官是由干细胞衍生的三维组织培养物，能够在体外自我组织形成“微型器官”，并重现其体内对应器官的许多结构和功能特征。类器官的生成可以源自诱导多能干细胞（iPS 细胞）或成体干细胞。类器官可以从正常组织以及上皮和非上皮肿瘤（如胶质母细胞瘤、肉瘤或神经内分泌肿瘤）中高效地获得。患者来源的肿瘤类器官（PDOs）能够进行功能性和动态性的研究以及肿瘤生物学建模，而不仅仅是对固定样本进行静态、单时间点的表征。与二维细胞系相比，类器官的优势包括更高的衍生率、生成患者匹配的正常组织和肿瘤配对、更好地保留原始肿瘤特征和患者间差异、长期培养且保持结构和遗传完整性以及生物样本库。与患者来源的异种移植（PDX）模型相比，PDOs 更快速且经济，它在细胞系和体内模型之间架起了桥梁，可能减少对动物研究的依赖。

传统的癌症类器官仅包含恶性癌细胞，这有利于确定肿瘤细胞自主过程的表征并易于遗传操作。然而，这种典型的癌症类器官缺乏包括免疫细胞在内的基质成分，而免疫细胞与上皮细胞的相互作用能够决定肿瘤的发生发展和对治疗等外部影响的反应。因此，迫切需要更复杂的类器官系统，包括肿瘤和TME成分，达到整体模拟癌症生物学和治疗的目的。目前研究主要集中在两类免疫器官模型：重组基质与免疫环境的类器官模型和原生免疫类器官模型。

图2：肿瘤免疫类器官模型相关优势和局限

1.1 重组基质与免疫环境的类器官模型

为了探究肿瘤免疫微环境，已建立的常规癌症类器官已被外源性地重新构建为不同的免疫细胞亚群（图 2）。目前基于类器官的重建工作包括多种免疫细胞类型或CAR-T 细胞。例如，促肿瘤生成的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）与小鼠乳腺肿瘤病毒-多瘤病毒中肿瘤抗原（MMTV-PyMT）癌症类器官共培养，增加了类器官的侵袭行为，而表达IL-4的CD4+ T细胞进一步增强了这种行为。将结直肠癌（CRC）或非小细胞肺癌（NSCLC）来源的类器官与扩增的自体外周血单核细胞（PBMCs）共培养，可生成肿瘤反应性 T 细胞。同样，PBMCs与胰腺肿瘤类器官共培养，克隆性扩增表达肿瘤靶向TCR的T细胞，并以患者特异性方式诱导细胞毒性。当细胞毒性T淋巴细胞（CTL）与肿瘤抗原致敏的树突状细胞（DC）共培养时，抗 PDL1 可诱导胃肿瘤类器官死亡。

肿瘤类器官与自然杀伤（NK）细胞共同培养可以评估抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，而单核细胞来源的树突状细胞（DCs）与肿瘤类器官共培养则揭示了肿瘤诱导的DC表型和功能。这些研究展示了传统的癌症类器官在转化医学和临床免疫肿瘤学研究中的潜在应用价值（见图2）。

未经纯化的患者来源的肿瘤单细胞悬浮液已被用于肿瘤细胞与匹配的浸润基质和免疫细胞的短期共培养，以研究肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）及其对免疫检查点抑制（ICB）的反应。微器官球（MOS）培养能够进行高通量诊断和药物测试。通过液滴微流控技术，从肿瘤活检单细胞悬浮液中生成成千上万个MOS，研究人员可以在活检采集后的14天内评估肿瘤对抗PD1抗体和双特异性抗体的反应（见图2）。

另一种方法是将解离后的黑色素瘤单细胞悬浮液在胶原蛋白或基质中培养，可保留免疫成分长达1个月，并通过IL-2和抗PD1治疗扩增和重新激活TILs来杀死肿瘤细胞。这种黑色素瘤培养使小分子筛选有了可能，揭示BCL-2抑制剂增强了TIL的功能。

但是，单细胞悬浮液中肿瘤成分的空间重排可能会消除现有的肿瘤-免疫细胞功能相互作用，可能影响关键免疫西部相互作用的体外再现、疾病进展和治疗反应。重组平台将单个肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞暴露于非生理性的细胞外基质（ECM）中，这可以调节癌细胞和免疫细胞的表型和功能。然而，这种基于单细胞悬浮液的方法允许多重评估，这可能有助于更高通量的筛选（见图2）。

1.2 原生免疫类器官模型

为了研究TME在其原始结构和ECM中的所有原生免疫和非免疫成分，已经开发了更加全面的类器官方法。这些研究TME的方法包括气液界面（ALI）类器官模型和患者来源的器官型肿瘤球体（PDOTS）（见图2）。

1.2.1 ALI类器官模型

在气液界面（ALI）培养中，肿瘤类器官是由物理剪碎的原代组织碎片生长而来，这些碎片被嵌入在胶原凝胶或其他细胞外基质（ECM）中，ALI培养方法允许在其中生成原生免疫类器官，在这种类器官中，肿瘤细胞与内源性基质和免疫群体一起成块生长。该模型保留了原发肿瘤的异质性、突变负荷和结构，而无需重新构建。

ALI模型能从多种正常组织中生成类器官，包括结肠、小肠、胃和胰腺。此外，ALI类器官也从同种小鼠中生长的鼠源肿瘤以及从人类活检获得的患者来源肿瘤类器官（PDOs）中建立，包括黑色素瘤、肾细胞癌（RCC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。这些类器官的肿瘤上皮可以进行连续传代并冷冻保存。ALI PDOs中的基质成分包括癌症相关成纤维细胞（CAFs）和广泛的免疫细胞群体，包括细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）、辅助T细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、自然杀伤（NK）细胞、B细胞和自然杀伤T细胞（NKT细胞）。ALI PDOs中的T细胞群体随着时间的推移会下降，但在培养中可以维持超过70天（见图2）。因此，ALI PDOs不仅保留了原始肿瘤细胞，还保留了复杂的肿瘤实质和基质，包括成纤维细胞和浸润的免疫细胞。ALI肿瘤类器官已被用于验证一种新型PD1抑制剂的体外活性，该抑制剂通过交联PD1与CD45来去磷酸化并抑制调节性和配体激活的PD1信号。此外，ALI肿瘤类器官还揭示了功能化IL-2和TLR1、TLR2、NOD2受体激动剂的纳米颗粒的抗肿瘤活性。它们还被用于研究抗髓系细胞上表达触发受体2（抗TREM2）在患者来源的基底细胞癌类器官中的治疗效果，结果表明，靶向TREM2+巨噬细胞能够诱导上皮细胞死亡。

1.2.2 器官型肿瘤球体

另一种类器官方法是生成小鼠来源的类器官肿瘤类球体（MDOTS）和患者来源的器官型肿瘤球体（PDOTS）。在这种方法中，小的肿瘤碎片（直径为40–100μm）被培养在微流控设备的中央通道中的胶原凝胶内，且两侧是含有培养基的平行通道。因此，来自同种免疫功能正常小鼠肿瘤和患者活检的培养物在该系统中培养1至2周，模拟肿瘤微环境（TME）及其对免疫检查点抑制（ICB）的动态反应（见图2）。流式细胞术的免疫分型表明，MDOTS和PDOTS不仅保留了肿瘤细胞，还包含自体淋巴细胞（B细胞和T细胞）以及髓系细胞（单核细胞、树突状细胞（DCs）、髓系抑制性细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs））。此外，这些系统成功评估了免疫治疗反应，包括模拟小鼠模型和患者样本中对免疫检查点抑制的体内反应和耐药性。研究者发现了环蛋白依赖性激酶4（CDK4）、CDK6和TANK结合激酶1（TBK1）的抑制剂，这些抑制剂能够增强免疫检查点抑制反应。

这些类器官方法在肿瘤具有较大内部空间变异性时，类器官之间的异质性限制了其应用。由于这些类器官能够代表原发肿瘤，因此获得足够且高质量的组织材料至关重要（图2）。此外，原生免疫类器官本身并不适合用于高通量药物筛选。肿瘤活检或手术切除通常是实现气液界面（ALI）和微流控技术的必要条件，通过细针穿刺活检（FNA）获得的活检样本来生成和培养原生免疫患者来源肿瘤类器官（PDOs）则是一种最小侵入性的方，目前已经从多种肿瘤类型（如黑色素瘤、胰腺癌、胃肠癌、甲状腺癌和肾癌）中成功生成了FNA来源的常规类器官（FNA-PDOs）。但是，任何在体外观察到的免疫治疗反应都需要与患者的临床结果进行前瞻性相关性分析，而这些初步的概念验证研究通常未获得相关的患者数据。总之，多种原生类器官方法不仅能保留原发肿瘤的基质和免疫成分，还能保持对肿瘤–肿瘤微环境（TME）相互作用至关重要的原生空间关系（图2）。

肿瘤免疫类器官的实验评估

TME类器官模型的系统评价对于确定癌细胞与其免疫微环境之间的相互作用以及探索免疫治疗及其耐药机制具有重要的潜力。许多分析类器官内免疫- TME相互作用的策略包括组织学检查、实时成像、多路免疫荧光和单细胞分析（图3）。

图3：肿瘤免疫类器官和免疫治疗作用

2.1肿瘤免疫类器官成像

传统的癌症类器官特别适合进行活体成像，因为这些类器官相对较小，且位于培养皿底部附近，便于进行免疫荧光分析或基因操作以表达荧光标记。重建的免疫类器官模型能够直观地展示免疫细胞或免疫疗法的直接作用。例如，对包含常规乳腺癌类器官与表达γδ TCR的CAR-T细胞共培养的重建免疫类器官模型进行活体共聚焦成像，并结合转录组学（BEHAV3D）分析，揭示了多个CAR-T细胞功能簇，并表明I型干扰素信号通路使癌症类器官对CAR-T细胞疗法更敏感（图3）。

光片显微镜能够快速且温和地获取复杂动态过程的活体图像，且不会改变被成像样本的生理状态。将高分辨率显微镜与在活体样本中对多种抗体进行多重标记的新技术（如裂解加速荧光交换技术SAFE）相结合，能够对活体类器官中的多种细胞类型和细胞间相互作用进行可视化。因此，将新型成像技术与免疫类器官模型相结合，能够实现对新型免疫疗法及其对癌细胞的清除作用进行前所未有的体外可视化（图3）。

虽然新型光学透明化和 3D成像技术尚未应用于原生免疫类器官的成像，但它们可以详细可视化组织中多种细胞类型之间的相互作用。这些方法利用固定和通透作用使抗体能够渗透并染色细胞内的蛋白质，但失去了对活体免疫相互作用进行成像的能力。通过索引实现共检测（CODEX）能够在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中对大量蛋白质标记物进行原位荧光可视化。结合计算分析框架，成像数据揭示了“细胞邻域”，从而将结直肠癌患者分为低风险或高风险肿瘤进展患者。同样，通过 CODEX 揭示的细胞拓扑结构可预测免疫治疗反应。多重离子束成像（MIBI）能够同时对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中的35种蛋白质标志物进行定量，并检测出具有不同临床结果的乳腺癌患者的新亚组。此类先进成像系统的近期商业化应有助于对原生免疫类器官中的蛋白质表达进行高度多重分析（图3）。

2.2肿瘤免疫类器官单细胞分析

单细胞技术的快速发展极大推动了生物学探索。例如，流式细胞术是检测异质性细胞群体的金标准技术，当前荧光染料检测技术的进步使得能够同时评估超过40种细胞蛋白标志物。此外，质谱流式细胞术，利用同位素标记的抗体与质谱联用，实现了同时检测40到50个参数的单细胞分析，并且在健康和癌变类器官及类器官共培养中提供了多重细胞类型特异性的翻译后修饰分析。在研究免疫检查点抑制（ICB）治疗的患者来源组织切片时，单细胞RNA测序与质谱流式细胞术结合，帮助定义了B细胞和局部淋巴结构（TLSs）在ICB治疗中的潜在作用。此外，将单细胞RNA测序与空间转录组学结合，能够定义免疫肿瘤微环境中生物过程的区域性（图3）。免疫类器官还可以进一步用于研究免疫治疗对这些过程的扰动，并揭示肿瘤细胞、免疫细胞和其他基质细胞中的细胞特异性靶点，这些都与优化免疫治疗密切相关。

2.3类器官的基因改造

基因工程显著增强了类器官在癌症生物学中的应用。传统的缺乏免疫成分的类器官可以通过病毒转导、Cre–lox和CRISPR–Cas9技术，作为单细胞悬液或小细胞团进行强有力的修改。通过这种方式，类器官的基因工程技术现已被广泛应用于评估特定基因事件对癌症发展的作用。基于CRISPR的策略已经扩展到点突变、报告基因盒的敲入以及在传统类器官中诱导染色体易位，这些与肿瘤发生和癌症干细胞生物学密切相关。最近，适应性同源非依赖性类器官转基因技术（CRISPR–HOT）成功地创建了荧光标记敲入报告基因的类器官，并应用于类器官共培养模型的成像。

传统的类器官功能基因组学筛选已经包括使用慢病毒cDNA文库进行候选驱动基因的扩增和删除。事实上，这些CRISPR筛选已经在体内进行，以定义肿瘤免疫逃逸所必需的基因，这些方法可以适用于原生癌症免疫类器官。利用CRISPR技术和单细胞RNA测序，扰动测序（perturb-seq）和CRISPR液滴测序（CROP-seq）已定义了单一导向RNA在一个池中的单细胞转录组，并发现了癌细胞和免疫细胞群体中的重要编码变异。但是，将这些基因策略扩展到未重建的原生免疫类器官系统可能会遇到潜在的限制。慢病毒和CRISPR操作在传统类器官中更易进行。相比之下，涉及组织碎片或切片的类器官培养系统较难进行此类操作，而且在包含多种不同细胞群体的培养物中，还存在细胞类型特异性基因表达的障碍。

精准医疗的应用

迄今为止，预测免疫治疗反应主要依赖于治疗前肿瘤的基因测序或组织化学分析。在一项关于抗PD1抗体疗效的大型荟萃分析中，免疫组化检测的PDL1表达、肿瘤突变负荷以及基因表达等多个因素虽然提供了适度的预测价值，但仍需改进。因此，来自活体患者的类器官为模拟个体化免疫治疗反应提供了一个重要机会。

由患者来源的类器官（PDOs）能够准确重建三维肿瘤结构、异质性和药物反应，远远超过了二维癌细胞系，这表明了PDOs在临床反应预测中的潜在应用价值。多项研究显示，在相应的PDOs中，患者对化疗、放疗、靶向药物或联合治疗的反应与其效果之间存在相关性。然而，复杂免疫肿瘤微环境（TME）对药物反应的调控，以及免疫治疗、化疗、放疗和靶向治疗引发的抗原呈递和抗肿瘤免疫反应仍然是个显著的问题。仅由癌细胞构成的类器官无法反映这一复杂的免疫肿瘤微环境，因此无法模拟这些反应。

相比之下，结合了基质和免疫成分的肿瘤模型可能会提高类器官的转化应用价值（图4）。在重建模型中，传统的癌症类器官通过外源性补充外周血淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）或CAR-T细胞，已被用于研究和预测患者对T细胞检查点抑制、双特异性抗体或免疫细胞疗法的反应，并取得了一定的成功。然而，通过微流控技术将解离的结直肠肿瘤块重新聚集成微器官球（MOSs），并保留了浸润的免疫细胞群体，确实展现了体外反应与临床反应之间的相关性。重构的CRC和非小细胞肺癌（NSCLC）PDO模型也已被用于选择和体外扩增来自外周血的肿瘤反应性T细胞群体，并分析肿瘤特异性T细胞反应。目前，采用患者来源的头颈部鳞状细胞癌重构免疫类器官模型正在进行较大规模的前瞻性试验。

来自非小细胞肺癌（NSCLC）患者的PDOTS研究表明，CDK4和CDK6小分子抑制剂的组合通过增强T细胞激活，增强了免疫检查点抑制（ICB）疗效。靶向 TBK1 可以克服转移性皮肤黑素瘤患者和微卫星不稳定性 (MSI) 高 CRC 患者的 PDOTS 中的 ICB 耐药性。

最后，ALI 类器官模型能够长期（长达 70 天以上）培养具有广谱肿瘤浸润免疫细胞的患者来源肿瘤。在约三分之一的ALI PDO中，TIL 在抗 PD1 和抗 PDL1 ICB 89后表现出特异性激活和肿瘤杀伤潜力。尽管这些研究并未专门设计用于将ICB效果与患者反应相关联，但原生免疫类器官模型，如PDOTS和ALI类器官，展现了在提高免疫微环境反应分析、预测和理解方面的潜力，并有助于改善肿瘤治疗的相关研究（图4）。

图4：肿瘤免疫类器官作为转化治疗模型

图5：非类器官肿瘤外植体培养

研究免疫疗法另一种有前途的方法是使用肿瘤外植体（图4、图5）。与类器官不同，肿瘤外植体是短期（48-96小时）培养的酶解或机械切碎的患者来源的肿瘤组织。在培养这些肿瘤外植体时，无论是否加入免疫检查点阻断（ICB）治疗，都显示出令人鼓舞的相关性结果。尽管每个患者来源的肿瘤片段的反应存在异质性，但通过对每位患者的多个肿瘤片段中细胞因子、趋化因子和T细胞活化标志物的综合分析，成功预测了对ICB的反应。

小结

肿瘤细胞与其免疫微环境之间复杂的相互作用对癌症进展起着至关重要的调节作用。近年来，使用类器官技术、肿瘤外植体和微流控技术取得了显著进展。虽然重建的免疫类器官不能完全反映完整的 TME，但这些策略可以有效优化细胞特异性免疫疗法，并极大地促进了基因修饰方法和高通量药物筛选平台。

许多障碍阻碍了当前免疫类器官模型从临床前研究到临床应用的过渡。但总体而言，类器官技术在当前的癌症研究革命中占有一席之位，其特点是肿瘤模型的快速进化和治疗方案的不断改进。正在进行的患者源性免疫类器官的持续发展表明，TME 的整体体外建模正在取得进展，并有可能引导更多的免疫治疗剂，从而切实改善患者的生存率。