细胞色素P450酶（P450s）是具有重要工业意义的生物催化剂，自然界中P450s执行广泛的代谢化学反应，不仅参与核心骨架分子的形成，还参与天然产物的区域和立体选择性修饰。P450s可以在温和的条件下催化空气中氧气的氧原子特异性添加到复杂的分子骨架中，而对于传统的化学合成方法来说，这是一项极具挑战性的工作。真核P450s的功能活性依赖其氧化还原分子伴侣-细胞色素P450还原酶（CPR）提供电子，二者通常位于内质网（ER）中，并通过其N-端疏水性的序列共定位在ER膜的胞质一侧。在原核生物中表达真核P450s系统时，与表达宿主之间存在膜识别信号相容性差的问题，这使得真核P450s系统普遍存在蛋白可溶性差、功能性弱和周转速率低等现象，成为合成生物学、代谢工程以及生物技术领域的一个重要挑战。因此，提高原核表达系统中真核P450s的活性，对于利用重组微生物进行高效生产相关生物活性的化合物具有重要意义。

江苏省中国科学院植物研究所汪仁研究员团队利用自主开发的模块化真核P450酶功能性表达策略，通过设计、重构与调整真核生物P450酶系统的空间架构，首次用实验证明了模拟自然状态下真核P450s系统的N-端引导共定位，重建N-端桥联表达的真核细胞色素P450s系统，克服真核P450s生物活性对真核细胞内膜的依赖，可以在重组原核细胞中显著提高植物天然产物和人类药物代谢物的关键中间产物合成。该研究还表明通过调整蛋白分子论文间的装配架构，不仅可以改善蛋白质复合物的生物合成性能，也将有助于促进真核细胞内膜蛋白分子间的结构与功能探索。该工作以“Tuning architectural organization of eukaryotic P450 system to boost bioproduction in Escherichia coli”发表在《Nature Communications》上。江苏省中国科学院植物研究所的李宜奎副研究员和李洁助理研究员是论文共同第一作者，汪仁研究员是论文的通讯作者。

Fig. 1: 真核P450系统空间组织。

【主要内容】

研究人员针对植物特异性CYP73A亚家族，构建了两种类型的串联融合嵌合体，并测试了其在大肠杆菌中催化反式肉桂酸形成p-香豆酸的生物合成性能。使用柔性肽接头作为插入铰链，将 CYP73A5^Δ2-28与 ATR2^Δ2-77的N-端或C-端融合，从而构建了两种类型的串联融合嵌合体: (i) CYP73A5^Δ2-28-L-ATR2^Δ2-77和(ii) ATR2^Δ2-77-L-CYP73A5^Δ2-28。通过比较两种不同嵌合体架构的合成能力，串联融合嵌合体(i) CYP73A5^Δ2-28-L-ATR2^Δ2-77的催化性能较好，其具有与细菌 CYP102A1类似的催化结构域排列。研究结果显示，在细胞中模拟天然存在的真核P450系统自然结构可以促进原核生物的生物合成性能。

Fig. 2: 嵌合体架构对真核P450酶生物合成性能的影响

为了扩展大肠杆菌中真核P450系统的架构，利用自组装肽生物机械作为媒介，在翻译后水平上空间组织CYP73A5^Δ2-28和ATR2^Δ2-77。通过在N-端或C-端将SpyCatcher与CYP73A5^Δ2-28融合，将SpyTag与ATR2^Δ2-77融合，创建了四个具有不同连接结构的CYP73A5^Δ2-28-ATR2^Δ2-77异源二聚体，并检测了它们在大肠杆菌中的生物合成性能。研究发现N-端桥联的异源二聚体（IV）在p-香豆酸的生物合成中显示出最高的产量，该结构与在植物细胞ER膜上CYP73A5和ATR2的N-端导向共定位的模式相似。因此，这种基于自组装肽的N-端桥联的P450和CPR 异源二聚体被认为是一个模拟真核细胞膜结合 P450系统的对应物。四个异源二聚体的体内合成能力有明显的差异，表明蛋白质组装的结构会对重建的真核P450系统的酶活性产生影响。

图3: 基于大肠杆菌自组装肽生物机器的植物 CYP73A5^Δ2-28和 ATR2^Δ2-77的结构组织。

为了进一步探索生物合成性能是否受到 N-端桥联异源二聚体的结构构型的影响，研究人员将CYP73A5^Δ2-28和 ATR2^Δ2-77的 N-端肽进行了交换。结果表明，基于 SpySystem 的 N-端桥联 CYP73A5^Δ2-28-ATR2^Δ2-77异源二聚体的结构构型对重组真核生物 P450系统在大肠杆菌中的生物合成性能有显著影响。研究人员为了研究肽支架对 CYP73A5^Δ2-28和 ATR2^Δ2-77的 N-端桥联异源二聚体的生物合成性能的影响，应用了 SnoopSystem连接系统。通过在 CYP73A5^Δ2-28和 ATR2^Δ2-77的 N-端成对附加 SnoopCatcher 肽和 SnoopTag 肽以替代 SpySystem 支架，进一步创建了两个 N-端桥联的异源二聚体。结果证实，无论在实验中使用的是共价自组装肽生物机器SpySystem还是SnoopSystem，N-端桥联CYP73A5^Δ2-28-ATR2^Δ2-77异源二聚体的生物合成性能都是稳健的。研究人员还尝试通过利用小鼠SH3结构域及其高亲和力肽配体(SH3lig)将 CYP73A5^Δ2-28和 ATR2^Δ2-77绑定为非共价 N-端桥联的异源二聚体。结果进一步证实，N-端桥联结构改善了植物 P450系统在大肠杆菌中的生物合成性能，并表明基于 SH3/SH3lig 系统的 N-端桥联 CYP73A5^Δ2-28-ATR2^Δ2-77异源二聚体的结构构型影响了重组真核 P450系统在大肠杆菌中的生物合成性能。

这些结果进一步证实了植物P450和氧化还原伴侣的 N-端束缚有利于提高真核生物 P450酶在大肠杆菌中的生物合成性能，同时也表明具有 N-端共价连接的重建植物 P450系统具有优异的性能，表明用于空间组织多酶级联生物反应器的自组装肽元件的稳定性可能对生物生产效率产生相当大的影响。

Fig. 4: CYP73A5^Δ2-28和ATR2^Δ2-77的N-端肽修饰对大肠杆菌中p-香豆酸生物合成的影响

此外，还研究了结构组织对大肠杆菌中人类CYP1A2与CPR 系统生物合成对乙酰氨基酚性能的影响，包括自组装多肽SpySystem构建四种不同架构的异源二聚体，N-端串联嵌合体和单独共表达的模式。结果表明，N-端桥联的蛋白自组装策略可用于组织人P450系统，以提高药物代谢物在大肠杆菌中的生物生产，也证实了这种策略在不同物种真核P450系统中的适用性。

Fig. 5: 人类P450系统的空间组织对大肠杆菌中对乙酰氨基酚生物合成的影响。

【结论】

研究团队利用翻译后自组装的方法，模块化的成功重建了植物和人类的II 类 P450 系统，创建了一种 N-端桥联的异源二聚体，用于改善了原核宿主中与P450相关的化学物质的生物生产。研究结果表明，实现了真核P450系统的结构与原核生物合成宿主性能的适配。因此，基于真核 P450 系统共有 CPR的特性，当生物合成途径涉及两种甚至更多的 P450 酶时，这种模块化空间结构引导的蛋白质组装方法为能够更高效地生物生产化学品提供了新的思路。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-54259-1