传统的RNA测序方法通过逆转录生成cDNA，然后进行扩增、测序等多个步骤，过程中可能会引入技术偏差导致分析不准确，且逆转录之后也失去了RNA表观修饰信息。纳米孔直接RNA测序（DRS）通过检测被捕获RNA分子穿过纳米孔时发送的电流信号变化进行解析，避免因逆转录和扩增引入的偏差，还可以解析RNA分子隐藏的所有信息，包括RNA全长的序列信息、polyA长度和RNA修饰修饰。因为不需要进行序列的拼接，可准确鉴定选择性剪接等转录调控。因此DRS被广泛应用于生理和病理条件下的转录组变化分析、表观转录组学、微生物组与宏转录组学等领域。

然而，目前DRS的广泛应用还面临着诸多挑战：首先，由于没有成熟的样本标记技术，当前纳米孔芯片仅能完成一个样本的测序，其高昂的成本限制了DRS的大规模应用；其次，碱基识别准确率较低，难以精准识别短外显子或高频突变位点；最后，单样本需百纳克级的poly(A) RNA输入量，对稀有样本（如微量活检组织）极不友好。现有DeePlexiCon、Demultiplex等工具最多仅支持4样本同步测序，但分类精度与计算效率难以满足临床需求。 

近日，四川大学陈路、林静雯、耿佳团队合作在Genome Biology期刊上发表了文章“DEMINERS enables clinical metagenomics and comparative transcriptomic analysis by increasing throughput and accuracy of nanopore direct RNA sequencing”。该研究开发出一款名为DEMINERS的创新DRS测序何分析框架，突破了传统DRS技术在样本混合、碱基识别及数据分析方面的局限，实现多达24个样本的同时直接测序（图1a-b）以及高达93.54%的碱基识别准确率（图1c），并成功应用于临床转录组学、微生物组学、癌症转录组学以及不同生物条件下的转录组特征对比（图1d）。

图1. DEMINERS框架图

在COVID-19的研究中，DEMINERS被用于测序与分析24名SARS-CoV-2感染者的11个鼻咽和13个口咽拭子样本。尽管样本中病毒RNA含量较低，DEMINERS仍成功地从样本中提取并比对出高质量的SARS-CoV-2基因组序列。通过RNA修饰分析，识别出了43个m⁶A修饰位点，并表明RNA修饰与突变之间可能存在潜在关系。进一步分析表明，病毒载量与口咽微生物多样性之间呈负相关，提示病毒的存在可能抑制了呼吸道微生物群体的多样性（图2）。

图2. 利用DEMINERS对COVID-19拭子样本进行宏基因组分析

疟原虫是引起疟疾的病原体，其滋养体（trophozoite）和裂殖体（schizonts）是其红细胞内发育时期的两个关键阶段，对疟原虫致病性起决定性作用。在疟原虫的研究中，DEMINERS用于分析滋养体和裂殖体阶段的转录组特征。研究发现，裂殖体阶段的转录本具有较短的Poly(A)尾巴和更高的m⁶A修饰水平。65.5%的m⁶A修饰位点仅在裂殖体阶段存在，表明这些修饰可能与疟原虫在不同发育阶段的基因调控密切相关。此外，DEMINERS还揭示了疟原虫中多种新型可变剪接体，尤其是裂殖体阶段表现出更高的剪接多样性，为研究新的抗疟靶点提供了数据支持（图3）。

图3. 不同阶段疟原虫转录组特征的平行比较分析

弥漫中线胶质瘤（DMG，常见于儿童中线脑区）和胶质母细胞瘤（GBM，成人侵袭性原发脑瘤）均以治疗抗性和分子异质性著称，解析其多维度调控网络是开发靶向疗法的核心挑战。DEMINERS成功分析了DMG和GBM样本中的突变、m⁶A修饰以及基因和剪接异构体的表达。研究发现，m⁶A修饰与GFAP基因的剪接异构体表达水平呈负相关关系。GFAP-214的m⁶A修饰水平显著高于GFAP-230，提示m⁶A修饰可能通过调控剪接异构体的生成进而影响胶质瘤的发生和发展。此外，DEMINERS与NGS的高一致性表明其在临床癌症研究中的应用前景（图4）。

图4. 人类胶质瘤中的RNA变异、剪接体和m⁶A修饰

综上所述，DEMINERS直测技术不仅在提高RNA测序的精度、降低成本和提高通量方面取得了显著进展，还在临床转录组学、病原体研究和癌症转录组学等多个领域展示了巨大的应用潜力。特别是在低RNA输入量和复杂样本的处理上，DEMINERS能够有效解决传统RNA测序测序技术面临的挑战。

原文链接：

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-025-03536-3